ELISA 實驗的一些原理總結(jié)

　　ELISA  即酶聯(lián)免疫吸附測定，是一類常用的免疫酶技術(shù)。主要方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，然后利用酶標(biāo)記(偶聯(lián))的抗體或抗原與之孵育，加入顯色劑顯色，通過酶標(biāo)儀測定待測物顏色與標(biāo)準(zhǔn)物顏色的差異，繪制出酶活曲線得出待測物濃度。

　　ELISA 可用于測定抗原，也可用于測定抗體。ELISA 實驗中有三種必要的試劑：

　　① 固相的抗原或抗體(用于結(jié)合到固相載體上)

　　② 標(biāo)記的抗原或抗體(標(biāo)記物)

　　③ 作用的底物(顯色劑，用于顯色)

　　四種常見 ELISA方法

　　1. 直接 ELISA

　　將抗原固定于 ELISA 板上，然后用酶標(biāo)抗體直檢測抗原。

　　相較于其它類型的 ELISA 實驗，直接 ELISA 實驗步驟少，檢測速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng)，測定結(jié)果不容易出錯。但是由于直接  ELISA 的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會與 ELISA 板結(jié)合，實驗背景會比較高。而且直接 ELISA  每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗，實驗不太靈活。另外由于沒有使用二抗，信號沒有被放大，降低了測定的靈敏度。

　　2. 間接 ELISA

　　先將抗原結(jié)合到 ELISA 板上，隨后分兩步進行檢測：首先加入檢測抗體與抗原特異性結(jié)合，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測并利用底物顯色。

　　與直接 ELISA 相比，間接 ELISA 用到酶標(biāo)二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的標(biāo)記抗體，更經(jīng)濟。間接 ELISA  還提供了更大的靈活性，因為不同的一抗能夠與單一標(biāo)記的二抗一同使用。間接 ELISA  實驗的缺點是存在交叉反應(yīng)的可能性(酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合)，可能會增加背景，同時與直接 ELISA 相比，間接 ELISA  實驗多了二抗孵育的步驟，實驗周期延長。

　　3. 夾心 ELISA

　　先將捕獲抗體固定于 ELISA 板孔中，然后加入樣品，接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標(biāo)抗體，則可稱為直接夾心  ELISA;如果檢測抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心 ELISA。

　　夾心 ELISA 的靈敏度高，它比直接或間接 ELISA 敏感 2-5 倍;同時夾心 ELISA  使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合，擁有很高的特異性。另外夾心 ELISA 能夠通過直接或間接的方式進行檢測，靈活性較高。夾心 ELISA  的缺點是對配對抗體要求很高，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對抗體，則需要進行配對抗體定制并進行優(yōu)化，因為降低捕獲抗體與檢測抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。

　　4. 競爭 ELISA 法

　　預(yù)先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標(biāo)記的特異性抗體。實驗時，加入待檢抗原(或抗體)，如果待檢物是抗原，則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體;如果待檢測物是抗體，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競爭結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加底物顯色。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原(或抗體)的量成反比。

　　競爭 ELISA 相對以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些，但以上三種 ELISA 類型都適用于競爭 ELISA  的形式。其主要優(yōu)點在于可檢測不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高，但存在整體敏感性和專一性較差的問題。

　　ELISA 常見問題與解決方法

　　1. 陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果

　　① 樣品、試劑被污染，或加樣時操作不當(dāng)導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑，小心操作。

　　② 酶標(biāo)板洗滌不——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒?jié)M板孔，確保能充分洗滌。

　　③ 抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當(dāng)濃度。

　　2.酶標(biāo)板整體背景高

　　① 抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。

　　② 底物結(jié)合濃度過高——對底物進行適當(dāng)稀釋。

　　③ 反應(yīng)時間過長——當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應(yīng)，適當(dāng)縮短顯色時間。

　　④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的，若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染，應(yīng)更換新的底物溶液。

　　⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進行。

　　3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差

　　① 樣品數(shù)量不整齊，加樣時間有長有短——加重復(fù)孔時盡量保持加樣時間與接近。

　　② 加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，并且使用同一移液槍。

　　③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測定樣品時，操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。

　　4. 吸光值偏高或偏低

　　① 樣品中待測抗原含量太低會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

　　② 加入抗體量不合適會造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的用量。

　　③ 孵育時間太短導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低——適當(dāng)延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結(jié)合。

　　④ 孵育溫度不適合——應(yīng)抗體在最適宜條件下進行孵育(一般 37℃ 孵育 1h )。

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